無菌接種步驟

  1.將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的紗布上或?yàn)V紙上。

  2.材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢Ｈ缛~片切成0.5cm平方的小塊;莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?～2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。

  3.用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程(以試管為例)是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動(dòng)，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基上。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1～3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無統(tǒng)一要求。接種完后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒種。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包口紙里面也要過火。

  褐化

  解決方案：在培養(yǎng)基中添加活性碳可以防止植物組織自身的酚類物質(zhì)排泌和變褐老化，對(duì)形態(tài)發(fā)生和器官形成有良好作用。一般認(rèn)為，活性碳主要吸附非極性物質(zhì)及色素大分子，可以減少一些有害物質(zhì)的影響，但是具體吸附的選擇性很差，溫度低時(shí)吸附力增強(qiáng)，溫度高時(shí)吸附力減弱，甚至?xí)馕剑ǔＪ褂脻舛葹?.5-10g/L。加入活性炭后使培養(yǎng)基變黑，對(duì)一些植物誘導(dǎo)生根有利。大量活性炭的加入會(huì)削弱瓊脂的凝固能力，因此要多加些瓊脂。很細(xì)的活性炭容易沉淀，因此通常在瓊脂將要凝固時(shí)，需輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶。

  酚污染

  解決方案：植物外植體組織在接種時(shí)的切割面會(huì)溢泌一些酚類物質(zhì)，在接觸空氣中的氧氣后，其會(huì)氧化為相應(yīng)的醌類物質(zhì)，產(chǎn)生可見的茶色、褐色或黑色，此即謂“酚污染”。在木本植物，尤其是熱帶木本植物及少量草本植物中，此現(xiàn)象較為嚴(yán)重。

  常用的防治措施如下

  1、試用抗酚類氧化的藥劑(半胱氨酸及其鹽酸鹽、二硫蘇糖醇、谷胱甘肽、抗壞血酸等。該類藥劑一般需用濃度為50-200mg/L。用經(jīng)過濾滅菌的藥液洗滌剛切割的外植體傷口表面，或加入固體培養(yǎng)基的表層，或?qū)偳懈畹耐庵搀w浸入其中一定時(shí)間)

  2、適當(dāng)降低培養(yǎng)基溫度。

  3、接種后先進(jìn)行一定時(shí)間的暗培養(yǎng)。

  4、及時(shí)轉(zhuǎn)接入新鮮培養(yǎng)基。

  5、選擇切取外植體部位等。