煙草(Nicotiana tabacum L.)是常用植物組培材料，組培存活率高，周期較短。中學植物組培實驗一直以來存在實驗工作繁重、整體實驗時間長等問題，培養基的配制繁瑣是重要原因之一。目前，科學家對簡化培養基配方已進行了相關研究，本實驗一方面通過減少煙草組培MS培養基成分探究培養基中的可去除營養成分;另一方面使用馬鈴薯替代MS培養基中各種成分，通過觀察煙草誘導分化現象是否滿足中學教學需求，篩選出適合教學的簡化培養基配方，達到節約人力成本和提高實驗效率的目的。

  1 材料與方法

  1.1 材料 煙草由華南師范大學生科院細胞工程實驗室提供;馬鈴薯(Solanum tuberosum)由市場購得。

  1.2 煙草葉片組培培養基篩選 選取生長良好的嫩綠煙草葉片洗凈，在已消毒的工作臺下用75%酒精浸泡30s，接著在濃度為5%的次氯酸鈉溶液浸泡9min，無菌水沖洗并切塊，接入以下培養基中：

  CK. MS培養基+6-BA1.0+NAA0.5(對照組);B. MS培養基-微量元素+6-BA1.0+NAA0.5;C. MS培養基-有機成分+6-BA1.0+NAA0.5;D. MS培養基-微量元素-有機成分+6-BA1.0+NAA0.5;E. MS培養基-微量元素-有機成分+6-BA1.0+NAA0.5+200g/L馬鈴薯溶液;F. MS培養基-大量元素-有機成分+6-BA1.0+NAA0.5+200g/L馬鈴薯溶液;G. MS培養基-大量元素-有機成分-微量元素+6-BA1.0+NAA0.5+200g/L馬鈴薯溶液;H. 200g/L馬鈴薯溶液。

  每個處理組5瓶，2次重復實驗，置于培養架上培養。培養溫度為室溫;光照強度為25～28μmol/m2·s;光照時間為12 h/d。 接種1～18d觀察污染情況;7～45d觀察外植體生長情況;25d統計誘導所需時間及芽的分化率;35d統計葉的分化率及根的分化率。

  1.3 數據統計與處理 污染率和芽、葉、根的分化率用SPSS 18.0軟件進行方差分析和多重比較(Duncan’s method，0.05)。接種培養的煙草葉片，每3d觀察一次，設置6個指標：

  污染率(%)=污染瓶數/總接種瓶數×100;壞死率(%)=褐化外植體數/除去污染的總外植體數×100;愈傷組織誘導率(%)=誘導出愈傷組織的外植體數/除去污染的總外植體數×100; 芽的分化率(%)=分化芽的外植體數/除去污染的總外植體數×100; 葉的分化率(%)=分化葉的外植體數/除去污染的總外植體數×100; 根的分化率(%)=分化根的外植體數/除去污染的總外植體數×100。

  2 結果與分析

  2.1 煙草葉片在缺素MS培養基中的生長狀況 如表1所示，比較對照組(MS培養基+6-BA1.0+NAA0.5)和B、C、D四種培養基，將煙草組織培養生長情況從良好到較差進行排序：對照組> B(缺有機成分)> C(缺微量元素)> D(缺有機成分和微量元素)。對比各項指標發現：MS培養基中有機成分對煙草誘導、分化影響不明顯，在一定程度上延遲根的分化。MS培養基中的微量元素對煙草誘導、芽的分化影響不明顯，對煙草葉、根的分化具有重要作用。同時缺乏微量元素和有機成分的MS培養基已經無法保證煙草組培的正常進行。考慮中學生物學教學節約成本和簡化步驟的需求，可以采用缺有機成分的F配方代替MS培養基進行實驗教學。

  2.2 煙草葉片在馬鈴薯替代的缺素MS培養基中的生長狀況 如表1所示，對比B-H可以發現相同缺素條件下，添加馬鈴薯汁的培養基能改善煙草葉片的生長狀況。對比對照組(MS培養基+6-BA1.0+NAA0.5)和四種添加馬鈴薯汁的缺有機成分MS培養基E、F、G、H，將煙草組織培養生長情況從良好到較差進行排序：對照組≥ E(馬鈴薯汁代替微量元素)> F(馬鈴薯代替大量元素)= G(馬鈴薯代替大量元素和微量元素)> H(馬鈴薯培養基)。馬鈴薯汁替代微量元素煙草組培生長良好，替代大量元素和微量元素能觀察到煙草外植體脫分化、分化出芽、葉和根的現象，但組培苗矮小。考慮到中學教學目標在于學生動手實驗，能夠明顯觀察到植物組培誘導、分化情況即可，CK中培養基中G(馬鈴薯代替大量元素和微量元素)配制時間短，效率高，且基本滿足教學需求。原本需要100min才能配制完成的MS培養基，G僅需30min。

  表1 不同培養基對煙草組培生長的影響

  3 討論

  簡化培養基的研究目的在于提高培養基配制效率。國內外學者的研究表明, 馬鈴薯、菊花等可以使用白糖、自來水代替蔗糖和蒸餾水，對組培效果影響不明顯。本實驗MS培養基配制使用自來水和蔗糖，結果表明有機成分對煙草組培影響不明顯，但未發現其對降低污染率有明顯效果。馬鈴薯培養基在微生物培養中十分常見，但在植物組織培養并未被廣泛接受。因為相比促進外植體誘導分化，其對微生物生長更加有利，容易提高污染率而導致實驗失敗。所以，關于馬鈴薯作為植物組培簡化培養基的研究較少。馬鈴薯的營養成分涵蓋大量元素的所有種類和微量元素的部分種類(除I、B、Mo)。本實驗中馬鈴薯代替微量元素的培養基中外植體愈傷組織、芽、葉均為淺綠色。雖然馬鈴薯中營養成分種類涵蓋范圍廣，但含量與MS培養基含量有差異，不能達到完全替代的效果。但能保證在教學周期內實驗成功完成，觀察到外植體正常誘導出愈傷組織，分化出芽、葉和根的現象。

  優化實驗條件之后的煙草離體培養實驗，滿足課程大綱對中學組培實驗教學“掌握培養基的配制、外植體消毒、接種、培養等基本操作技術”的實驗要求，且未對教學內容產生影響。同時，結合本實驗對煙草組培單一配方的篩選結果，可以使用200g/L馬鈴薯代替MS培養基中的大量元素和微量元素制備煙草組培簡化培養基。而該簡化培養基使得原本需要配制100min的MS培養基在30min內完成，可大大降低前期準備的工作量，提高組培實驗的教學效率，減少組培所需時間和降低人力成本。