柳枝稷為多年生草本C4植物，在北美洲廣泛種植。柳枝稷植株高大，具有根系發(fā)達(dá)、防風(fēng)固沙能力強、耐瘠薄等優(yōu)點，是沙漠綠化的理想植物。柳枝稷可合成燃料乙醇、甲醇、沼氣、氫氣等，由于其能源產(chǎn)出率高，在乙醇生產(chǎn)過程中易降解，被美國政府確定為替代玉米生產(chǎn)燃料乙醇的首選能源植物。保存并快速繁殖材料是現(xiàn)代生物育種技術(shù)的重要研究內(nèi)容。研究發(fā)現(xiàn)，柳枝稷是一種異型雜交的多倍體單子葉植物，具有高度的自交不親和性。因此，通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得具有高遺傳力的柳枝稷轉(zhuǎn)基因品種變得尤為重要，轉(zhuǎn)基因育種的前提是建立的植物組織培養(yǎng)體系。現(xiàn)有的柳枝稷組培研究中，外植體多為葉片、莖尖、節(jié)間及幼穗，以這些材料作為外植體，愈傷誘導(dǎo)率普遍較低，且容易受生長周期及季節(jié)限制。本研究以柳枝稷成熟種子為材料，探索愈傷誘導(dǎo)過程中很好外源激素配比，從而建立柳枝稷種子組培快繁體系，旨在為開發(fā)利用柳枝稷資源提供依據(jù)。

  1 材料與方法

  1.1 材料

  柳枝稷品種為Alamo(北京市農(nóng)林科學(xué)院)，用自來水沖洗脫殼后的成熟種子，去掉雜質(zhì)，用無菌水浸泡12 h，沖洗后風(fēng)干，置于4℃冰箱中備用。

  1.2 方法

  1.2.1 培養(yǎng)基配制 愈傷組織誘導(dǎo)及分化以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，采用3因素3水平進(jìn)行試驗(表1)，pH值為8.0。生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA(0.4、0.8、1.2、1.6 mg/L)+3% 蔗糖+0.75% 瓊脂，pH值為8.0。配制完成后，121℃高壓滅菌15 min，待溫度冷卻至50～60℃時搖勻，倒入培養(yǎng)皿中，置于超凈臺風(fēng)干備用。

  1.2.2 種子處理 挑選干燥飽滿的種子，首先用6%NaClO溶液消毒2.5 h，輕輕攪動使NaClO與種子充分接觸，然后用無菌水清洗3～5遍，浸泡12 h。之后用6%NaClO溶液消毒20 min，用無菌水清洗種子3～5遍。在無菌條件下，將處理好的種子接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

  1.2.3 培養(yǎng)條件 選擇同一批成熟種子作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及分化試驗，每處理重復(fù)5次，每個培養(yǎng)皿中接種30粒種子，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)30～45 d后，選擇株高為2～4 cm的再生苗，切下幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，繼續(xù)置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個組培瓶接種12個外植體，每濃度重復(fù)4次，培養(yǎng)10～15 d。愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基試驗因素及水平見表1。GZX-300BS-4光照培養(yǎng)箱(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)培養(yǎng)溫度設(shè)置為24℃，光照培養(yǎng)時間為16 h/d，光照強度為12000 lx。

  1.2.4 生長指標(biāo)測定 接種后，每3 d統(tǒng)計1次胚芽數(shù)目、胚根出現(xiàn)時間及數(shù)目、愈傷組織出現(xiàn)時間及數(shù)目等指標(biāo)。培養(yǎng)30～45 d后，統(tǒng)計種子發(fā)芽率及愈傷誘導(dǎo)率，確定很好愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基激素配比。在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)一段時間后觀察愈傷組織的生長情況，觀察并統(tǒng)計分化出的不定芽生長情況及數(shù)目。愈傷誘導(dǎo)分化培養(yǎng)完成后，接種到生根培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)10～15 d，觀察不同濃度NAA對再生苗生根的影響，記錄生根外植體及根的數(shù)目。

  表1 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基試驗因素及水平

  2 結(jié)果與分析

  2.1 不同激素配比對種子萌發(fā)時間及萌發(fā)率的影響

  由表2可知，培養(yǎng)5～7 d后，大多數(shù)種子都能在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上萌發(fā)，且不同濃度激素對柳枝稷種子的萌發(fā)時間及萌發(fā)率均有顯著影響。當(dāng)2，4-D濃度為6 mg/L、6-BA 濃度為1.0 mg/L、NAA 濃度為0.6 mg/L 時，種子接種后3 d即開始萌發(fā)，萌發(fā)率達(dá)82%。當(dāng)2，4-D濃度為6 mg/L、6 -BA 濃度為1.5 mg/L、NAA 濃度為 1.2 mg/L 時，種子萌發(fā)時間延遲，接種后7 d才開始萌發(fā)，且萌發(fā)率僅為35%。由此可知，柳枝稷種子萌發(fā)的很好培養(yǎng)基為MS+2，4 - D 6 mg/L+6 - BA 1.0 mg/L+NAA 0.6 mg/L。

  表2 不同濃度激素配比對芽形成及愈傷組織誘導(dǎo)的影響

  注:“+++”表示愈傷組織長勢很好，形成的愈傷組織數(shù)目、大小均比較理想;“++”表示長勢良好;“+”表示長勢一般，形成的愈傷組織數(shù)目較少，體積較小。

  2.2 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)及分化培養(yǎng)的影響

  經(jīng)消毒處理的成熟種子培養(yǎng)5 d后，部分培養(yǎng)基上開始有愈傷組織形成，隨后逐漸變大，并且隨著愈傷組織的增大其表面逐漸變得干燥，質(zhì)地緊密結(jié)實，顏色多為黃色、嫩綠色(圖1-a)。當(dāng) 2，4-D濃度為2 mg/L、6-BA濃度為0.5 mg/L、NAA 濃度為1.2 mg/L時，形成愈傷組織所需的時間很長，即培養(yǎng)12 d后才能觀察到愈傷組織的形成。不同激素配比下，外植體愈傷組織的長勢也有顯著差別(圖1-b)。在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d后，不同激素配比處理下愈傷組織在色澤、大小等指標(biāo)方面差異較大，愈傷誘導(dǎo)率很高可達(dá)82%，很低僅為35%(表2)。一部分愈傷組織色澤淡黃，體積較小且表面干燥疏松;另一部分愈傷組織色澤嫩綠，體積較大且表面緊實，具有較強的再分化能力，可用于誘導(dǎo)成苗。這些生長狀態(tài)良好的愈傷組織培養(yǎng)一段時間后體積逐漸增大，且伴隨出現(xiàn)一些白色顆粒狀胚狀體。繼續(xù)培養(yǎng)10 d后，有些原本白色的胚狀體凸起，分化為嫩綠色的幼芽(圖1-c)。隨著培養(yǎng)時間的延長，新形成的幼芽逐漸變綠，并且直立生長，有的幼芽長勢較快，接種到培養(yǎng)基上15 d后可長至2～3 cm。體積較小的愈傷組織接種一段時間后，分化出一些零星的幼芽，隨后幼芽停止生長。將切割后的分化組織接種到新培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d，有的芽能長出長約4～6 cm的新葉，并從嫩綠色變成翠綠色(圖1-d)。愈傷組織誘導(dǎo)及分化的很好培養(yǎng)基為 MS+6 mg/L 2，4-D+1 mg/L 6-BA+0.6 mg/L NAA+3% 蔗糖 +0.75% 瓊脂，pH值為8.0。

  2.3 不同濃度NAA對不定芽生根的影響

  在愈傷組織誘導(dǎo)及分化的很好培養(yǎng)基上培養(yǎng)40 d后，愈傷組織開始分化出大小不一的不定芽。選擇長勢較一致的不定芽切割后接種到含有不同濃度NAA的生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根誘導(dǎo)(圖1-e)。結(jié)果表明，當(dāng) NAA濃度為 0.8 mg/L時，生根時間很短，7 d后即可觀察到白色凸起并逐漸形成新根，生根率可達(dá)90%以上(表3)，每棵再生苗均能誘導(dǎo)出15～20條新生根(圖1-f)。當(dāng)NAA濃度過低(0.4 mg/L)或者過高(1.6 mg/L)時，新根都會延遲出現(xiàn)。在生根的同時，新生苗新葉長勢良好(圖1-g)，平均長約10 cm，部分甚至高達(dá)20 cm(圖1-g)。

  表3 不同濃度NAA對不定芽生根率及生根數(shù)目的影響

  2.4 煉苗

  當(dāng)大部分新生苗長出數(shù)量不一的新根后，將組培瓶上的封口膜去掉，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，隨后將培養(yǎng)基取出置于室溫下培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基表面加入少許無菌水，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后，將新苗從培養(yǎng)基中輕輕取出，避免損傷根部。用無菌水將幼苗表面的培養(yǎng)基沖洗干凈，移栽至花盆中繼續(xù)培養(yǎng)，用塑料薄膜覆蓋以防止水分大量流失。每天用無菌水澆灑新苗，待新苗長勢穩(wěn)定后，將花盆搬至室外繼續(xù)培養(yǎng)煉苗(圖1-h)。當(dāng)培養(yǎng)條件適合時，大部分幼苗都能正常存活，并且穩(wěn)定生長(圖1-i)。

  3 結(jié)論

  研究發(fā)現(xiàn)，2，4-D、TDZ結(jié)合使用對柳枝稷愈傷組織的形成起促進(jìn)作用。認(rèn)為，添加不同濃度的2，4-D及6-BA對柳枝稷的愈傷誘導(dǎo)、分化再生有明顯影響。傳統(tǒng)的柳枝稷組培步驟較繁瑣，包括愈傷誘導(dǎo)、繼代、分化及生根等環(huán)節(jié)，耗時較長，且產(chǎn)率較低。利用柳枝稷成熟種子作為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)及分化，研究滅菌處理及不同濃度激素組合對愈傷組織誘導(dǎo)及分化的影響，包括愈傷組織誘導(dǎo)、分化、生根等環(huán)節(jié)，耗時較長。在愈傷誘導(dǎo)過程中，添加一定濃度的6-BA可改變愈傷組織的質(zhì)量，提高植物分化再生頻率。有研究表明，2，4-D對愈傷組織形成有比較明顯的促進(jìn)作用，很少被植物細(xì)胞所代謝，且不同濃度的2，4-D與其他一些細(xì)胞分裂素結(jié)合，可以建立組培體系。NAA是廣譜型植物生長調(diào)節(jié)劑，能促進(jìn)細(xì)胞分裂和擴大，誘導(dǎo)分化組織形成不定根。本研究表明，不同濃度配比的激素愈傷誘導(dǎo)率差異較大，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加 6 mg/L 2，4-D、1 mg/L 6-BA、0.6 mg/L NAA進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，愈傷誘導(dǎo)率可高達(dá)82%。愈傷組織誘導(dǎo)增殖后，在很好激素配比培養(yǎng)基上可直接進(jìn)行分化培養(yǎng)，能進(jìn)一步分化出大量新生芽。本方法有效縮短了再生時間，節(jié)約了試驗成本，提高了效率。室內(nèi)煉苗7 d后，將柳枝稷新生苗移至室外培養(yǎng)，可正常存活