1.將初步洗滌及切割的材料放入燒杯,帶入超凈臺上,用消毒劑滅菌,再用無菌水沖洗,然后瀝去水分,取出放置在滅過菌的紗布上或濾紙上。
2.材料吸干后,一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀,對材料進行適當的切割。如葉片切成0.5cm平方的小塊;莖切成含有一個節的小段。微莖尖要剝成只含1~2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經常灼燒接種器械,防止交叉污染。
3.用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養基上。具體操作過程(以試管為例)是:先解開包口紙,將試管幾乎水平拿著,使試管口靠近酒精燈火焰,并將管口在火焰上方轉動,使管口里外灼燒數秒鐘。若用棉塞蓋口,可先在管口外面灼燒,去掉棉塞,再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內,輕輕插入培養基上。若是葉片直接附在培養基上,以放1~3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放外,其他尚無統一要求。接種完后,將管口在火焰上再灼燒數秒種。并用棉塞,塞好后,包上包口紙,包口紙里面也要過火。
褐化
解決方案:在培養基中添加活性碳可以防止植物組織自身的酚類物質排泌和變褐老化,對形態發生和器官形成有良好作用。一般認為,活性碳主要吸附非極性物質及色素大分子,可以減少一些有害物質的影響,但是具體吸附的選擇性很差,溫度低時吸附力增強,溫度高時吸附力減弱,甚至會解吸附,通常使用濃度為0.5-10g/L。加入活性炭后使培養基變黑,對一些植物誘導生根有利。大量活性炭的加入會削弱瓊脂的凝固能力,因此要多加些瓊脂。很細的活性炭容易沉淀,因此通常在瓊脂將要凝固時,需輕輕搖動培養瓶。
酚污染
解決方案:植物外植體組織在接種時的切割面會溢泌一些酚類物質,在接觸空氣中的氧氣后,其會氧化為相應的醌類物質,產生可見的茶色、褐色或黑色,此即謂“酚污染”。在木本植物,尤其是熱帶木本植物及少量草本植物中,此現象較為嚴重。
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